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教你快速了解制备型液相色谱

点击次数:2580 发布时间:2017-04-06
  制备型加压液相色谱,按照色谱柱和样品量的大小,分为:(1)低压液相色谱;(2)中压液相色谱;(3)高压液相色谱;(4)快速色谱。低压、中压与高压液相色谱的压力范围之间会存在一定交叠,没有统一、明确的标准。
  1.快速色谱
  柱压通常为2bar(或30psi)左右,对于那些容易分离的简单混合物,由于快速色谱具有操作简便、经济等优点,常常是实验室的。但快速色谱不同于一般的层析分离,这种分离没有压力,而快速分离通常使用瓶装氮气加压,使流动相具有一定的流速,从而缩短了分离时间。
  快速色谱使用的柱子一般是玻璃柱,柱直径为3~10cm.长度为7~15cm。快速色谱中使用zui广泛的固定相为硅胶。采用的粒径通常为:25~40μm,40~63μm或63~200μm的球形固定相。其它如键合相、氧化铝、聚酰胺吸附剂也常用作快速色谱的固定相使用。
  2.低压色谱(LPLC)
  柱压一般低于5bar(或75psi)。
  低压色谱一般是由蠕动泵、进样阀和检测器组成,可以连续化,实现自动的梯度淋洗和馏分收集等操作。色谱柱管一般是玻璃或聚合物材料的,长度一般为240-440mm,内径为10-40mm。
  对于大多数在紫外区有吸收的物质,光学检测器很常用。填料一般使用软质的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、合成高聚物或离子交换剂,粒径一般为40-60μm。
  3.中压液相色谱(MPLC)
  柱压在5-20bar(或75-300psi)之间,广泛用于实验室和工业规模的生物制品(如动物脏器提取液、浓缩液、体液、植物提取液、生物技术发酵液等--往往需要经过滤膜作初级净化)的处理,以提取或纯化所需的产品。
  中压液相制备色谱的主要部件为输液泵、进样阀、检测器、馏分收集器等,早期的中压液相制备色谱,其输液泵zui大流速可达156mL/min,并配有阻尼器,以保证液流的稳定;进样器配有0.5-50mL的不同体积的定量管;检测器有紫外和示差折光检测器,流通池体积比较大,允许大流量流动相通过而无需分流;馏分收集器有原盘式和排式两种,原盘式的接收管zui多达80个,而后者则更多;色谱柱内径9-105mm,长度250-1760mm不等。
  对于一般中压制备色谱,当色谱柱直径较大时,柱头往往设计成锥形或有类似于伞状的液流导向结构,使得当大量样品进入到柱头上时,能迅速地分散到整个柱横截面上,及时被流动相冲走,避免了因样品的局部过浓而引起柱超负荷和谱带加宽。柱子填料则采用比较耐压的交联改性的多糖凝胶(如Sepharose CL,Superose等),聚合物微球,复合材料介质或硬质SiO2基体的化学键合相等,粒径一般在25~40μm(zui常用的填料尺寸是15-25μm,25-40μm或40-63μm),可采用湿法或干法装柱。
  4.高压液相色谱(HPLC)
  是指柱压一般大于20bar(或300psi)的“高压(或)液相色谱”,通常指所用色谱柱的塔板数大于2000,一般是在2,000~20,000的范围之间。
  当需要从大量的物质中分离纯化不足1%的所需成分时,分离工作将会十分困难,往往在纯化的zui后阶段需要使用10μm或更小颗粒的填料。为获得所需微量组分,可采用如下分离手段:制备型分离→半制备型分离→分析型分离→产物。为提高每次分离获得纯品的数量,制备型高压液相色谱分离通常在超载情况下运行。
  高压液相色谱,即目前常用的液相色谱。色谱柱内填装的是粒度范围较窄的微小颗粒固定相(3~30μm),为使流动相流出,需采用较高的压力,同时系统的复杂性及成本亦增大,但分辨率可得到较大的提高。而填装较大颗粒的固定相时,如中压液相色谱系统,装柱较容易,柱的通透性较高(只需较低的泵压力),可采用更大的色谱柱和更经济的仪器,由此分辨率也较低。
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  用分析型高压液相色谱进行制备型分离
  当所需纯化合物的量很少时(微克级至几毫克),可用分析型色谱柱进行多次分离。效果和利用大直径色谱柱进行一次性分离相同。采用小直径色谱柱时,可利用已有的分析型仪器,而无需在色谱柱、填料及附件方面投入更大资金;另外,还可在很大程度上避免由于放大所产生的问题,使分离速度加快。
  小直径色谱柱的尺寸一般为250×4.6mm,通常装有反相填料,每次可进样5~100ug,通过多次进样分离,可获得足够的纯品。例如,Suzuki等(1994)报道从豆科植物羽扇豆(Lupinus Hirsutus)中分离一羽扇豆生物碱糖苷时,其zui后的分离步骤采用LiChrosorb Si60,5μm,250×4.6mm色谱柱进行高压液相色谱分离,洗脱剂为含25%甲醇的yi醚溶液-5%氨水50:1。
  经常需用分析型色谱柱进行分离的一个领域是对肽类化合物的纯化。生物活性肽的含量通常很低,用分析型高压液相色谱作为zui后的纯化手段时,不会使色谱柱超载。
  为了提高分离效率,可将分析型高压液相色谱柱连接起来使用。此时可采用颗粒度在20~30μm的填料,以保持适当的通透性,尤其是当使用含水溶剂时。当使用己烷等有机溶剂时,由于流动相的粘度较低,可使用颗粒度为10μm的填料。
  然而由于分析型色谱系统无法提供大规模制备型分离所需的流速,其应用受到一定限制。
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