在液相色谱分析中，
二元高压梯度系统凭借其高精度、高重现性的优势，已成为复杂样品分离分析的首要选择技术。梯度程序的正确设定与优化，直接决定了分离效果、分析效率和结果的可靠性。本文将系统阐述二元高压梯度系统梯度程序的设定方法、关键参数调整策略以及常见问题的解决方案，为分析工作者提供一套完整的操作指南。
一、梯度程序设定的基础准备
1.系统配置确认是设定梯度程序的第一步。二元高压梯度系统由两台高压泵、在线混合器、色谱柱和检测器组成。在开始设定前，需确认：
①两台泵分别连接正确的流动相；
②管路连接无泄漏，溶剂已充分脱气；
③色谱柱类型与流动相兼容；
④系统已完成排气和平衡操作。这些基础准备工作是确保梯度程序准确执行的前提。
2.软件界面熟悉至关重要。不同品牌仪器的工作站软件界面略有差异，但核心功能模块相似。通常包括：泵参数设置、梯度程序表、检测器参数、柱温箱设置等。建议初次使用者先通过软件模拟功能预览梯度曲线，确认设置无误后再执行实际运行。
二、梯度程序的核心参数设定方法
1.初始条件设定
初始条件决定了梯度洗脱的起点。在二元系统中，流动相A和B的初始比例总和必须为100%。例如，若采用乙腈-水体系，初始比例可设为A泵（水）95%、B泵（乙腈）5%。初始比例的选择需考虑样品中最早洗脱组分的保留特性——若初始有机相比例过高，可能导致弱保留组分过早洗脱，分离度不足；若过低，则可能延长分析时间。一般建议根据预实验结果或文献方法确定初始比例，对于未知样品可从低有机相比例（如5%）开始探索。
2.梯度时间与斜率设置
梯度时间（tG）指从初始比例变化到终止比例所需的时间，直接影响分离效率和峰容量。梯度斜率（即单位时间内有机相比例的变化率）的计算公式为：斜率=(B终-B初)/tG。例如，从5%乙腈到95%乙腈，梯度时间20分钟，则斜率为4.5%/min。
设定原则：
①对于组分极性差异大的复杂样品，应采用较长的梯度时间（如30-60分钟）和缓和的斜率，以提高分离度；
②对于简单样品或高通量分析，可采用短梯度时间（5-10分钟）和陡峭斜率，缩短分析周期；
③若目标组分集中在某一时间段出峰，可采用分段梯度——在关键区域放缓斜率，其他区域快速变化，实现"局部优化"。实际设定时，可在工作站软件中直接输入时间点对应的B泵浓度，系统会自动计算斜率。
3.终止条件与平衡时间
梯度程序结束时，通常需要设置一段"保持时间"，使流动相比例稳定在终止比例，确保所有组分全部洗脱。随后，系统应自动切换回初始比例，并保持足够时间进行柱平衡，为下一次进样做准备。若平衡不充分，会导致保留时间漂移、峰形变差。现代工作站软件通常提供"自动平衡"功能，可根据系统延迟体积自动计算所需平衡时间。
4.流速与压力参数
二元高压梯度系统的总流速由两台泵的流速之和决定。流速设置需考虑色谱柱规格和系统耐压上限。对于常规分析柱，流速通常设为1.0mL/min；对于UPLC系统或小内径柱，流速相应降低。压力上限应设置为色谱柱和系统允许的最大压力的80%左右，以保护色谱柱和泵系统。梯度洗脱过程中，由于流动相组成变化，系统压力会随之波动，这是正常现象，但需监控压力曲线是否平稳，避免剧烈波动。
三、梯度程序的优化调整策略
1.基于分离效果的参数调整
当初始梯度程序运行后，若出现以下问题，需针对性调整：
①分离度不足：若目标峰与相邻杂质峰未全部分离，可尝试：延长梯度时间，降低斜率、在目标峰出峰区域设置"平台"，增加该区域的分离时间、调整初始或终止比例，改变目标峰的保留位置，避开干扰峰。
②峰形拖尾或前伸：可能是流动相pH或缓冲盐浓度不匹配，需优化流动相添加剂，而非单纯调整梯度程序。
③保留时间漂移：检查柱温是否稳定、流动相是否充分平衡、系统延迟体积是否准确校准。若为系统性问题，需重新平衡色谱柱或检查泵的混合精度。
2.梯度曲线类型的灵活运用
除线性梯度外，二元高压梯度系统还支持多种曲线类型，可根据分离需求选择：
①凸形梯度：起始变化快，后期变化慢，适用于早期组分分离度差、后期组分易分离的样品。
②凹形梯度：起始变化慢，后期变化快，适用于早期组分易分离、后期组分难分离的样品。
③阶梯梯度：在特定时间点直接切换比例，适用于组分极性差异极大的样品，但可能引起基线波动。
大多数工作站软件提供"梯度曲线编辑器"，可通过拖拽曲线上的控制点来调整梯度形状，实现更精细的优化。
3.系统延迟体积的校正
系统延迟体积会影响梯度程序的"实际执行时间"。若未校正，会导致保留时间滞后。校正方法：
①查阅仪器说明书获取标准延迟体积值；
②通过实验测定——运行一个从0%到100%的快速梯度，记录检测器响应时间与程序设定时间的差值，计算实际延迟体积。现代仪器通常内置自动校正功能，在软件中输入实际延迟体积后，系统会自动补偿，确保梯度程序准确执行。
四、常见问题与解决方案
1.基线漂移或波动：梯度洗脱中，若两种流动相的紫外吸收差异较大，易导致基线漂移。解决方案：
①使用高纯度溶剂，减少杂质干扰；
②在检测器前增加参比池，进行基线扣除；
③若漂移严重，可考虑使用缓冲盐或添加剂平衡紫外吸收，或改用其他检测波长。
2.压力异常波动：梯度过程中压力剧烈波动可能原因：
①流动相混合不均匀，产生气泡；
②泵密封圈磨损；
③混合器堵塞。需检查溶剂脱气是否充分、泵头是否漏液、混合器是否需清洗。
3.重现性差：若多次运行同一梯度程序，保留时间或峰面积差异大，需检查：
①流动相配制是否准确（建议使用称量法而非体积法）；
②柱温是否稳定；
③泵的混合精度是否达标（可通过运行空白梯度验证）；
④色谱柱是否老化或污染。
结语
二元高压梯度系统的梯度程序设定是一项理论与实践相结合的技术。掌握基础参数设置方法、理解梯度曲线对分离的影响、学会基于色谱图反馈进行针对性优化，是提升分析质量的关键。建议初学者从简单线性梯度开始，逐步尝试分段梯度、曲线梯度等复杂程序，通过实际样品反复验证，积累经验。随着对样品性质、色谱柱特性和仪器性能的深入理解，梯度程序的设定将更加得心应手，最终实现高效、精准的分离分析目标。
