高效液相色谱系统是一种基于色谱分离原理的分析技术，广泛应用于药物研发、环境监测、食品科学等领域。其核心优势在于高分辨率、高灵敏度及快速分析能力。以下从前期准备、系统启动、样品处理、运行分析、数据处理及维护保养六个关键环节展开详细描述：
一、前期准备阶段
1. 流动相配制与净化
- 根据实验需求选择合适溶剂(如甲醇、乙腈、水等)，按比例混合后经0.22μm滤膜真空脱气，避免气泡干扰泵的稳定性。
- 缓冲盐溶液需现用现配，防止微生物滋生；强酸碱调节pH时需缓慢滴加并校准至目标值。
- *示例*：反相C18柱常用甲醇-水体系，正相硅胶柱则采用正己烷-异丙醇混合液。
2. 色谱柱选型与活化
- 依据待测物极性匹配固定相类型(如C18、苯基柱适用于非极性化合物，氨基柱用于糖类分析)。
- 新柱启用前需用高比例有机相(如纯甲醇)冲洗至少30分钟，随后过渡至工作条件平衡。旧柱再生时可采用梯度程序清除残留杂质。
3. 标准品与样品预处理
- 固体样品需溶解于适当溶剂，液体样本稀释至线性范围内；复杂基质(如血浆、土壤)需经SPE固相萃取或蛋白沉淀去除干扰物。
- 所有溶液经离心/过滤后装入自动进样瓶，避免颗粒堵塞管路。
二、系统启动与参数设置
1. 硬件自检与初始化
- 开启电源后等待各模块就绪(泵压力稳定、检测器预热完成)，通过控制软件核查泄漏报警、废液桶容量等状态。
- 安装对应规格的保护柱+分析柱，注意进出口方向标识，拧紧接头防止死体积产生。
2. 方法编辑与序列编排
- 设定流速(通常1.0~1.5mL/min)、柱温箱温度(±0.1℃精度)、检测波长(DAD全波段扫描可选)。
- 梯度洗脱程序设计原则：起始高比例水相→逐步增加有机相比例→末期高比例有机相冲刷柱子。
3. 系统平衡验证
- 注入空白对照连续进样3次，观察基线波动≤±1mAU视为达标；若出现鬼峰需延长平衡时间或更换流动相。
三、样品分析执行
1. 自动进样标准化操作
- 编程设定进样体积(常规20μL，微量可降至1μL)、清洗次数(针内外壁各≥3次)。
- 特殊样品采用“partial loop”模式减少交叉污染，高温易分解物质启用冷却托盘功能。
2. 实时监控与应急响应
- 密切关注压力曲线：突升可能源于管路堵塞，骤降提示渗漏；保留时间漂移超过±0.1min需排查流速误差。
- 突发停电立即关闭高压阀，来电后重新平衡系统再行检测。
3. 质量控制穿插运行
- 每批插入QC标准品校验仪器稳定性，RSD%>2%表明系统异常；中间校核对多点校正曲线有效性至关重要。
四、数据采集与解析
1. 色谱图优化处理
- 运用平滑算法降低噪声，手动扣除背景吸收；重叠峰启用切线峰谷分割法定量。
- DAD检测器可通过纯度因子判断共流出组分纯度，MS联用时提取特征离子流图辅助定性。
2. 定量计算模型构建
- 外标法直接拟合浓度-峰面积曲线，内标法则选用结构类似物补偿基质效应。
3. 报告生成与合规存档
- GLP规范要求完整记录原始数据、审计追踪日志；PDF报告包含方法详情、图谱截图及结论陈述。
五、系统关机与日常维护
1. 深度清洗流程
- 关机前切换至高比例有机相(如甲醇:水=9:1)冲洗60分钟，再用纯甲醇封存柱子。
- 每月一次大保养：拆洗在线过滤器，超声清洗单向阀球体，更换老化peek管段。
2. 耗材寿命管理
- 建立泵密封垫更换台账(约200小时/次)，进样针弯曲及时更换；氘灯能量衰减至初始值70%以下需更新。
3. 性能验证周期表
- 季度执行系统适用性测试(理论塔板数≥2000，拖尾因子0.9~1.5)；年度计量溯源认证确保检测结果法律效力。
